ღეროვანი უჯრედები

ჟურნალი ,,კავკასიის სამედიცინო მაცნე”, N22, თებერვალი, 2010 წ.

ჭიპლარის სისხლის ღეროვანი უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობის შესწავლა დინამიკაში 7-AAD საღებავით გამდინარე ციტომეტრიის მეშვეობით

ავტორები:
ზურაბ ალხანიშვილი, ნინო გვასალია, ლანდა ლურსმანაშვილი
(სამეცნიერო -კვლევითი ცენტრი RADIX )
კვლევის ხელმძღვანელი:
ქართულ-გერმანული სპეციალიზირებული ონკოლოგიური კლინიკის, ჭიპლარის სისხლის ღეროვანი უჯრედების ბანკ ჯეოქორდის ხელმძღვანელი გიორგი ლოლაძე, გოჩა შათირიშვილი
წარმომდგენი ორგანიზაცია: თბილისის სახელმწიფო უნივერსიტეტი.

ღეროვანი უჯრედი არის უჯრედი, რომელსაც აქვს როგორც თვითგანახლების, ასევე მომწიფებული, სპეციალიზებული უჯრედების წარმოქმნის უნარი. მათ აქვთ პოტენციალი წარმოშვან თითქმის ყველა ტიპის უჯრედები. 
ღეროვანი უჯრედების ძირითად წყაროს წარმოადგენს: ძვლის ტვინი, პერიფერიული სისხლი, ჭიპლარის სისხლი.
ღეროვანი უჯრედის უნარი შეინარჩუნონ საკუთარი თავი პროლიფერაციით არის ყველაზე მნიშვნელოვანითვისება, რაც საშუალებას იძლევა მოხდეს მათი იდენტიფიცირება. მხოლოდ მათ აქვთ განუსაზღვრელი სიცოცხლის უნარი და ამავე დროს შეუძლიათ გამრავლება.

ჭიპლარის სისხლი და ღეროვანი უჯრედები

ჭიპლარის სისხლი არის სისხლი, რომელიც ჭიპლარის ვენაშია და პლაცენტაში ( მომყოლში) რჩება ბავშვის დაბადების და ჭიპლარის გადაკვანძის შემდეგ. ჭიპლარის სისხლი დიდი რაოდენობით შეიცავს ღეროვან უჯრედებს.
ჭიპლარის სისხლი მდიდარია სისხლმაბადი ღეროვანი უჯრედებით. ჭიპლარის სისხლში CD34+ სისხლმბადი ღეროვანი უჯრედების კონცენტრაცია ათჯერ მეტია ვიდრე მოზრდილთა ძვლის ტვინში, ამასთანავე აქედან აღება გაცილებით ადვილი და უსაფრთხოა.
ჭიპლარის სისხლის გადანერგვა წარმოადგენს ძვლის ტვინის ტრანსპლანტაციის სრულფასოვან ალტერნატივას.
CD34 ანტისხეულები გამოიყენება სისხლმბადი ღეროვანი უჯრედების საიდენტიფიკაციოდ, დასათვლელად და გამოსათავისუფლებლად როგორც სამეცნიერო, ასევე კლინიკური მიზნით (მაგალითად ძვლის ტვინისა და ჭიპლარის ღეროვანი უჯრედების ტრანსპლანტაციის დროს).

CD34 არის უჯრედის ზედაპირული გლიკოპროტეინი და წარმოადგენს ადჰეზიის ფაქტორს, CD34 პროტეინი არის ტრანსმემბრანული სიალომუცინის ოჯახის წევრი, თუმცა დღემდე მისი ფუქცია ზუსტად არაა გარკვეული. CD34 ნორმაში აღმოჩენილია ძვლის ტვინში, მეზენქიმურ ღეროვან უჯრედებში, ჭიპლარის სისხლში, სისხლის ენდოთელურ უჯრედებში

CD45–პანლეიკოციტური ანტიგენია, ტრანსმემბრანული პროტეინი, რომელიც განთავსებულია ყველა ჰემოპოეტურ უჯრედში, გარდა ერითროციტებისა.

CD45 არის ფერმენტი და სასიგნალო მოლეკულა, რომლებიც არეგულირებენ უჯრედის ზრდას, დიფერენცირებას, მიტოზურ ციკლს,და ონკოგენურ ტრანსფორმაციას.

7-AAD 7-Aმინოაცტინომყცინ D (7-AAD) არის ფლუოესენტული საღებავი, რომელიც დნმ-ის ორჯაჭვიან სპირალს უერთდება. Mაგრამ საღებავი დაუზიანებელ უჯრედულ მემბრანაში ძნელად აღწევს, ხოლო მკვდარი უჯრედის მემბრანაში კი ადვილად შედის და ღებავს დნმ-ს, რის გამოც ამ საღეავით შეღებილი უჯრედები არასიცოცხლისუნარიანადაა მიჩნეული.

გამდინარე ციტომეტრია

გამდინარე ციტომეტრიის მეთოდით ხდება უჯრედების სუსპენზიის იმუნოფენოტიპირება–უჯრედის მემბრანაზე არსებული ცილების-antigenebis identifikacia, ღეროვანი უჯრედების რაოდენობრივი და პროცენტული შემცველობის დადგენა, ასევე მოწმდება მათი სისცოცხლისუნარიანობა.
ანალიზის პრინციპი:
სპეციალურ სითხე ამწკრივებს გამოსაკვლევ უჯრედებს ისე, რომ თითოეულმა მათგანმა სათითაოდ გაიაროს ლაზერის სხივი აღქმისათვის– ჰიდროდინამიკური ფოკუსირება. გამდინარე ციტომეტრი აღმოაჩენს 1–50 მკმ ზომის უჯრედებს.

opti

ოპტიკური სისტემა:

ლაზერი. ლაზერის უჯრედში გასვლისას ლაზერის სხივი აირეკლება და განიბნევა სხვადასხვა კუთხით. დაბალი კუთხით გაბნეული სხივს ეწოდა -Forward scatter (FS), ხოლო გვერდულად გაბნეული სხივების (side scatter-SS) კი გამოწვეულია უჯრედის შიდა სტრუქტურული სირთულითა და მარცვლოვანობით . პირდაპირ სხივებს აღიქვამს დეტექტორი, რომელიც სინათლის ინტენსიობას ვოლტაჟად გარდაქმნის. ვოლტაჟი პროპორციულია უჯრედის ზომისა. სპეციალურ გრაფიკზე – ჰისტოგარამაზე მცირე ზომის უჯრედები ხვდება მარცხნივ, ხოლო დიდი ზომის უჯრედები კი მარჯვნივ. და გვერდულად გაბნეულ სხივებს აგროვებს ლინზა და შემდგომ აღიქვამს გვერდული სხივების დეტექტორი, რომლიც ლაზერის სხივთან 90 გრადუსითაა განლაგებული. რომელიც წარმოშობს და გარდაქმნის ელექტრულ სიგნალებს, რომლებიც შემდგომ დამუშავდება კომპიუტერის მიერ და გვაძლევს ორგანზომილებიან გრაფიკს, ციტოგრამას, სადაც ასახულია FS და SS, სადაც ლიმფოციტები მცირე ზომის უჯრედებია ნაკლებად რთული შიდა სტრუქტურით, უფრო მარჯვნივ და ზემოთ არის განლაგეული მონოციტები–უფრო მოზრდილი უჯრედები მეტი სირთულის შიდა სტრუქტურით და გრანულოციტები რთული სიდა სტრუქტურით და დიდი ზომის უჯრედები.

გარდა უჯრედის ზომისა და შიდა სტრუქტურისა, გამდინარე ციტომეტრიას შეუძლია გამდინარე ციტომეტრიის მეთოდით ხდება უჯრედების სუსპენზიის იმუნოფენოტიპირება–უჯრედის მემბრანაზე არსებული ცილების შემადგენლობის დადგენა, და შედეგად სხვადასხვა ტიპის უჯრედების რაოდენობრივი და პროცენტული შემცველობის დადგენა, ასევე მოწმდება მათი სისცოცხლისუნარიანობა.

ფლუორესენტული საღებავით მონიშნული ანტისხეულები ემაგრებიან უჯრედის შესაბამის ზედაპირულ ცილებს. ამგვარად შეღებული უჯრედების ნაკადი – წამში ასეული და ათასობით გაივლის ლაზერის სხივს, დროის ერთ მომენტში ერთი უჯრედი, და ამ დროს ლაზერით აგზნებული ფლუორესცირებადი საღებავის მიერ გამოსხივებული სინათლის აღქმა ხდება სპეციალური დეტექტორით. სხვადასხვა საღებავს გამოსხივების ტალღის დამახასიათებელი სიგრძე აქვს, და ადვილი გასარჩევია ერთმანეთისგან. სხვადასხვა ფერისს სიგნალი ერთმანეთისგანს სპეციალური ოპტიკური სისტემითა და ფილტრებიტ შორდება და სპეციფიურ დეტექტორზე ხვდება, ვოლტაჟად გარდაიქმნება და სტატისტიკურად გადამუშავდება კომპიუტერული პროგრამით. ანალიზი საშუალებას იძლევა ერთდროულად დავადგინოთ ცილების ექსპრესია უჯრედის ზედაპირზე და აქედან გამომდინარე, მოვახდინოთ უჯრედების იდენტიფიკაცია, მათი აბსოლუტური და პროცენტული რაოდენობა, სპეციალური საღებავის გამოყენებისას კი დავადგინოთ უჯრედების სიცოხლისუნარიანობა. როცა ცნობილია, თუ რომელი საღებავითაა ანტისხეული მნიშნული, ადვილია უჯრედების ტიპის იდენტიფიცირება.

აღნიშნული კვლევა ჩატარებულ იქნა თბილისში, ჭიპლარის სისხლის ბანკ ჯეოქორდის ბაზაზე.

შესწავლისლი იქნა ჭიპლარის სიხლის 10 ნიმუში.

ჭიპლარის სისხლის ბირთვიანი უჯრედები გამოთავისუფლდებოდა სტანდარტული ოქმით ჰიდროქსიეთილსახამებლისა (450 კდ) მეშვეობით, დაბალი და მაღალი სიჩქარით (50 g da 400 g) ცენტრიფუგირებით. მიღებული უჯრედების მასა ინახებოდა საკუთარ პლაზმაში, რომელსაც მირეული ჰქონდა ციტრატის ხსნარი (CPDA–1) და ასევე ჰიდროქსიეთილსახამებელი პლაზმის მოცულობის 20%.
მიღებული უჯრედული სუსპენზიიდან დაუყოვნებლივ, გაყინვამდე, აღებული იქნა მცირე ალიქვოტი და ამ მასალიდან ყოველი ცდისათვის აღებული იქნა 1 მილიონი უჯრედი. მასალა ინახებოდა პლაზმაში, უშაუალოდ ანტისხეულებით ინკუბირების წინ ცენტრიფუგირებით მოშორებული იქნა პლაზმა მინარევებით და უჯრედები დამუშავდა anti- CD–34 PE და anti-CD-45 FITC (Beckman), 20-20 მკლ, და7-ADD დამატებით 20 წუთის ინკუბირების შემდგომ 100 მკლ ბუფერში 0,5% BSA PBS –ში სიბნელეში 4 გრადუსზე, და გაშვებული იქნა ბეკმანის გამდინარე ციტომეტრზე იზოტიპირებისა და Flow Check კალიბრაციის შემდგომ, 100000 მოვლენამდე მოდიფიცირებული ISHAGE ოქმით (მოდიფიცირება გამიხატებოდა 7–AAD საღებავით შეღებვაში). (1)(2)(3)
თითოელი ნიმუშისთვის ეს ოქმი სრულდებოდა 3 ჯერ, 0, 3 და 6 სააზე მასალის აღებიდან.
გამდინარე ციტომეტრის პასუხების სტატისტიკურად დამუშავების შემდგომ დგინდებოდა: შესანახ ნიმუშში არსებული ბირთვიანი უჯრედების პროცენტი, CD 34 + უჯრედების პროცენტი, ISHAGE ოქმით დადგენილი სისხლმბადი ღეროვანი უჯრედების პროცენტი, ტოტალური უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობა, ბირთვიანი უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობა და ღეროვანი უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობა. ეს მონაცემები შესწავლილი იქნა დროის დინამიკაში (0, 3 და 6 საათში,).

მიღებული შედეგები:
ჭიპლარის სისხლის ღეროვანი უჯრედების ხანგრძლივი დროით კრიოპრეზერვაცია აუცილებელი პირობაა მათი წარმატებული ტრანსპლანტაციისათვის. ჭიპლარის სისხლის დამუშავების პერიოდში უჯრედების სიცოცხლიუნარიანობის მაქსიმალური შენარჩუნება კრიოპრეზერვაციამდე, კრიოპრეზერვაციის ნიადაგისთვის სწორად შერჩუელი ინგრედიენტები, უჯრედების ეტაპობრივი გაყინვის პროგრამა პროგრამირებულ გამყინავში და შემდგომი სწორი შენახვა თხევადი აზოტის რეზერვუარში-ის უმნიშვნელოვანესი საფეხურებია, რომლებიც უზრუნველყოფენ ჭიპლარის სისხლის ღეროვანი უჯრედების ხარისხიან და საიმედო შენახვას მათი სიცოცხლისუნარიანობის მაქსიმალური შენარჩუნებით ათწლეულების განმავლობაში.

ჩვენს მიერ შესწავლილი იქნა ჭიპლარის სისხლის უჯრედების სიცოცხლიუნარიანობის დამოკიდებულება უჯრედების დამუშავების დასრულებიდან კრიოპრეზერვაციის დაწყებამდე პერიოდზე.

შEსწავლისლი იქნა 10 ნიმუში, თითოეული IშHAGE ოქმით 7-აად საღებავით შეღებილი უჯრედები დროის 3 უბანზე: 0, 3 და 6 საათი.
თითოელ ნიმუშის დროს ვიკვლევდით 4 პარამეტრს: ჩD45 დადებითი უჯრედების პროცენტს, ჩD45/34 დადებითი უჯრედები (ჰემოპოეტური ღეროვანი უჯრედები) პროცენტს, 7-აად საღებავით შეღებილი(ანუ არასიცოცხლისუნარიანი) ჩD45 დ უჯრედების პროცენტს და 7-აად საღებავით შეღებილი(ანუ არასიცოცხლისუნარიანი) ჩD45/34 დადებითი უჯრედები (ჰემოპოეტური ღეროვანი უჯრედები) უჯრედების პროცენტს.

4 პარამეტრის შესწავლისას მიღებული მონაცემები მოწმობს, რომ საკუთარ პლაზმაში ჭიპლარის სისხლის ლეიკოციტების, სისხლმბადი ღეროვანი უჯრედების პროცენტული შემცველობა და სიცოცხლისუნარიანობის პროცენტი 0, 3 და 6 საათის განმავლობაშე ერთმანეთისგან მნიშვნელოვნად არ განსხვავდება. როგორც უჯრედების შემცველობა, ასევე მათი სიცოცხლიასუნარიანობა ამ პერიოდის მანძილზე შენარჩუნებულია და აკმაყოფილებს ყველა საერთაშორისო სტანდარტს, რაც ჭიპლარის სისხლის ღეროვანი უჯრედებისთვის სადღეისოდაა შემუშავებული-90-95% სიცოცხლისუნარიანობა (7-აად საღებავიტ დადგენილი) კრიოპრეზერვაციამდე და 85-90% კრიოპრეზერვაციის შემდგომ.
ჩვენი შედეგებით ჩD45 დადებითი უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობა 0 საათზე იყო 97.5%, 3 საათზე 95,8% და 6 საათზე-96.5%
ხოლო სისხლმბადი ღეროვანი უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობა შესაბამისად:
0 საათზე 97%. 3 საათზე 93.5%, 6 საათზე 95.7%
მუხედავად იმისა, რომ ჭიპლარის ბანკ ჯეოქორდში დამუშავებული უჯრედების კრიოპრეზერვაცია დაუყოვნებლივ იწყება (ანუ 0 საათზე), ჩვენს მიერ მიღებული შედეგები ადასტურებს, რომ თეორიულად, დამუშავებული, საკუთარ პლაზმაშმაში უჯრედების კრიოპრეზერვაციის 3 და 6 საათის შემდგომ დაწყების პირობებშიც კი უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობა მხოლოდ უმნიშვნელოდ იცვლება, ეს გაზრდიდა ბანკის მიერ დღის განმავლობაში დამუშავებული ნიმუშების რაოდენობას, რადგან გაყინვამდე უჯრედების სწორი შენახვა უფრო მოქნილს გახდიდა პროგრამული გამყინავის მუშაობას.

1

2

3

4

5