По данным ВОЗ травматизм занимает третье место в ряду причин общей смертности населения. В группе лиц моложе 45 лет травматизм стойко занял первое место по смертности [3].
Травматический шок (ТШ), крайнее проявление травмы, как и критические состояния любого генеза, сопровождается активацией свободнорадикальных процессов в тканях и органах больного [4, 6]. Все функционально значимые свободные радикалы, образующиеся в организме, содержат в своем составе кислород. Воздействуя на такие клеточные компоненты, как липиды, белки, нуклеиновые кислоты, вызывают повреждение тканей и смерть клеток [17]. В обычных условиях уровень свободных радикалов контролируется собственной эндогенной антиоксидантной системой защищающей ткани от оксидационного повреждения. При различных патологических состояниях, когда нарушается функция эндогенных антиоксидантов, свободные радикалы активируют перекисное окисление липидов (ПОЛ), повреждают клеточную мембрану, меняют трансмембранный ионный баланс, вызывая тем самым смерть клеток [18].
Глубокое изучение этих процессов даст возможность уточнить роль свободных радикалов в развитии патологических изменений при ТШ и найти более эффективные методы интенсивной терапии.
Иммуномодулирующий препарат Плаферон ЛБ, созданный в Институте медицинской биотехнологии АН Грузии под руководством акад. В.И.Бахуташвили, обладает антиоксидантным и антитоксическим свойствами [8, 9, 12, 5].
Целью данной работы было изучение проявлений окислительного стресса в огранизме белых крыс при ТШ и влияния Плаферона ЛБ на них.
Материалы и методы исследования. Эксперимент проводили на 30 половозрелых крысах-самцах со средней массой 200 гр. Критерием шокового состояния при моделировании шока был избран уровень артериального давления в сонной артерии. ТШ у крыс воспроизводили по методу Кеннона, травматизацией мягких тканей бедра до развития артериальной гипотензии (60±2 мм Нg). Через 15 мин после наступления шока животным внутрибрюшинно вводили: в I группе – только физиологический раствор в количестве 0,3 мл, во II группе – Плаферон ЛБ в дозе 0,03 мг в пересчете на белковое содержание на 0,3 мл физиологического раствора. Через 30 минут после введения препаратов животных забивали. Также была исследована контрольная группа интактных животных (8 крыс). Для исследования оксидативных процессов кровь исследовали биохимическими методами и методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР).
Для ЭПР исследования кровь собиралась в полиэтиленовые контейнеры и замораживалась в жидком азоте (-196ºС). ЭПР-спектры образцов измеряли на радиоспектрометре РЭ-1307 (Россия).
Материал был обработан методом вариационной статистики. Достоверными считались различия при p<0,05.
Результаты исследования и обсуждение. Анализ ЭПР исследования крови показал, что у животных обеих групп в ЭПР-спектре появились сигналы, характерные для инактивированного состояния адренорецепторов (g=2,01) (табл.1), которые в котрольной группе животных не наблюдались.
Инактивация адренорецепторов клеток крови (эритроцитов и лимфоцитов) может быть вызвана как десинситацией рецепторов (в результате избыточного выброса катехоламинов), так и пероксидацией мембранных липидов, что в свою очередь, является причиной и/или результатом неконтролируемой генерации свободных радикалов. Даже незначительное снижение чувствительности адренорецепторных структур нарушает регуляцию функции тканей, ослабляет защитные и адаптационные реакции организма, что способствует развитию патологических процессов.
Одним из самых значимых свободных радикалов кислорода является супероксидрадикал. Одним из наиболее известных и хорошо изученных его генераторов является фермент ксантиноксидаза [14, 27]. В здоровых клетках последний представлен в основном в виде NADH-зависимой ксантиндегидрогеназы. При различных патологических процессах этот фермент превращается в оксидантпродуцирующую форму, которая индуцирует оксидантный стресс [26, 28].
Ксантиноксидаза в своем активном центре содержит Mo5+, что позволяет выявить ее ЭПР-методом. У животных контрольной группы в ЭПР-спектре крови Mo5+содержащие комплексы не регистрировались. Возникновение данных сигналов при ТШ свидетельствует об активации ксантиноксидазы, приводящей к продукции свободных радикалов, характерных для данной патологии. Интенсивность данного сигнала в группе животных, где был введен Плаферон ЛБ, была статистически достоверно ниже по сравнению со II группой.
ПОЛ представляет собой классический путь образования вторичных кислородных свободных радикалов и обусловливает изменение структуры и нарушение целостности фосфолипидной мембраны. Окисление Fe2+ гемоглобина гидроксилрадикалом (ОН.) интенсифицирует процессы ПОЛ, в результате образуется метгемоглобин [34]. Таким образом, появление в крови крыс с ТШ ЭПР-сигналов метгемоглобина (g=6,0) свидетельствует об интенсификации процессов ПОЛ при данной патологии (см. табл.1).
Оксид азота (NO) является одним из наиболее изучаемых свободных радикалов. Многие металлы биологической значимости связывают непарный электрон NO-молекулы [23]. ЭПР-метод позволяет идентифицировать металлосодержащие центры, обладающие свойством парамагнетизма. Комплексы NO с металлопротеинами, содержащими железо и другие металлы, имеют характерные ЭПР-спектры [24,15,35,31]. Связывание металлосодержащих белков с NO сопутствует обратимая и необратимая ингибиция ферментов, содержащих гемовое и негемовое железо – цитохромоксидаза, цитохром Р-450, оксидоредуктаза, нитроредуктаза, NOS и др. [33, 19].
При повышении уровня супероксидрадикалов, NO входит в реакцию с ними и образует цитотоксический пероксинитрит [2, 11, 29, 10], который вызывает повреждение тканей воспалительного характера [7, 20]. Длительная продукция NO, обусловленная скоплением супрессора опухолевого роста-53, приводит к индукции апоптоза [1, 25]. Несмотря на то, что супероксиданион также вызывает индукцию апоптоза, одновременное существование этих двух радикалов в сбалансированной пропорции оказывает перекрестный защитный эффект и апоптоз значительно тормозится [1].
При ТШ в крови животных был зафиксирован не характерный для интактных животных сигнал нитрозильного комплекса негемового железа FeS-NO (табл.1), что говорит об интенсификации образования окиси азота. В обеих опытных группах ЭПР-сигналы FeS-NO были одинаковой интенсивности.
Появление интенсивных ЭПР-сигналов свободного железа (Fe2+) в крови животных с ТШ свидетельствует о деструкции ткани (табл.1). Известно, что ионы Fe2+ играют значительную роль в ПОЛ [16, 30, 32]. Интенсивность данных сигналов статистически достоверно ниже во II группе животных (p<0,05).
Таким образом, проведенное нами исследование показало, что при ТШ интенсификация процессов ПОЛ и активация фермента ксантиоксидазы приводит к избыточной продукции свободных радикалов. Под действием Плаферона ЛБ происходит резкое понижение активности ЭПР-сигналов, свидетельствующих об снижении активности ксантиноксидазы (Mo5+содержащие комплексы) и снижении содержания свободного железа (Fe2+) в крови.
Так как эндогенная антиоксидантная система организма, контролируя повреждающее действие свободных радикалов, играет огромную роль в нормализации метаболических процессов, следующая часть нашей работы была посвящена изучению состояния данной системы.
Как показали результаты наших исследований, в крови животных I группы увеличивается интенсивность ЭПР-сигнала окисленного церуллоплазмина и снижается ЭПР-сигнал Fe3+трансферрина (табл.1). Церуллоплазмин обладает пероксидазной и аминооксидазной активностью [13]. Благодаря пероксидазным свойствам церуллоплазмин связывает ионы железа из сыворотки крови и переносит их к апотрансферрину [21]. Антиоксидантные свойства Fe3+трансферрина объясняются его способностью связывать ионы железа. Исходя из вышесказанного, увеличение содержания неактивного церуллоплазмина и уменьшение уровня Fe3+трансферрина говорит о снижении антиоксидантной активности крови. Во II группе животных данные показатели достоверно не различаются от аналогических параметров интактных животных (контрольная группа).
О состоянии антиоксидантной системы крови можно судить также и по ЭПР-сигналу Mn2+содержащего комплекса. Так как Mn2+ входит в состав СОД митохондрий, зафиксированное нами появление ЭПР-сигнала Mn2+содержащих комплексов (g=2,14) при ТШ говорит об инактивации СОД митохондрий. Во II группе интенсивность данных сигналов была статистически достоверно ниже, чем в I группе. Так как Mn2+ также входит в состав биологических мембран, появление данных комплексов в крови может быть показателем и деструкции мембран.
На фоне активации эндогенной антиоксидантной защиты, Плаферон ЛБ тормозит ПОЛ и продукцию свободных радикалов азота и кислорода, что должно сопровождаться снижением выработки супероксиднитрита [10] и, соответственно, уменьшать воспалительное повреждение тканей [7]. Одним из механизмов, лежащих в основе данного эффекта препарата, видимо, является торможение активности фосфолипазы А2 [22].
Выводы:
1. Возникновение ЭПР-сигналов метгемоглобина, Fe2+, FeS-NO и Mo5+-содержащих комплексов, снижение интенсивности ЭПР-сигнала Fe3+ трансферрина и значительный рост уровня сигналов окисленного церуллоплазмина и Mn2+-содержащих комплексов свидетельствует о проявлении оксидантного стресса: активизируются процессы ПОЛ, гиперпродуцируются свободные радикалы и тормозится функция эндогенной антиоксидантной системы.
2. Плаферон ЛБ при экспериментальном ТШ способствует нормализации текущих в организме метаболических процессов: Плаферон ЛБ статистически достоверно снижает интенсивность ЭПР-сигналов Fe2+, церуллоплазмина, Mn2+- и Mo5+-содержащих комплексов и увеличивает интенсивность ЭПР-сигнала Fe3+-трансферрина, что является показателем торможения синтеза свободных радикалов, замедления процессов ПОЛ и активации активности антиоксидантных ферментов.
Литература:
1. Брюне Б., Сандау К., Фоннетен А. Апоптическая гибель клеток и оксид азота: механизмы активации и антагонистические пути. Биохимия, 1998, т.68,(7), стр.966-975.
2. Григлевский Р.Е. Участие свободных радикалов в преображениях эндотелиального простациклина и окиси азота. Новости фармации и медицины, 1997, 1-2, стр. 2-8.
3. Дерябин И.И., Насонкин О.С. Травматическая болезнь. Л.: Медицина, 1987 г.
4. Моррисон В.В., Кудин Г.Б., Нефедова Н.А. Состояние процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в динамике экспериментальной синегнойной интоксикациию. Анестезиология и реаниматология, N 3, 2000, стр. 41-43.
5. Рухадзе Р., Накашидзе И., Чиковани Т., Квезерели М. Влияние Плаферона-ЛБ на структурно-функциональные изменения в крови и печени при экспериментальном травматическом шоке. Научные труды II Международного конгресса «Современные методы диагностики и лечения аллергии, астмы и иммунодефицитов» Intrn.J/Immunorehab., 2001, v.3, N3, p.147-148.
6. Рябов Г.Я., Азизов Ю.М., Дорохов С.И., Кулабухов И.И., Титова И.А., Пасечкин И.Н., Бражник Т.Б., Рыбинцев В.Ю. Окислительная модификация белков плазмы крови у бильных в критических состояниях. Анестезиология и реаниматология, N 2, 2000, стр. 72-75.
7. Ahn B., Han B.S., Kim D. J., Ohshima H. Immunohistochemical localisation of inducible nitric oxide syntase and 3 nitrotyrosine in rat liver tumors induced by N-nitroodiethy lamine. Carcinogenesis, 1999, V.20, N7, p. 1337-1344.
8. Bakhutashvili V., Chikovani T., Cheishvili N., Bakhutashvili A. “Immunomodulatory activity of Plaferon LB” Georgian Symp. Projecte Devel. Convention, Collec. Of Rerports, Tbilisi, 1998, p. 189-191.
9. Bakhutashvili V., Shakarishvili R, Geladze T., Tatishvili N., Bakhutashvili A., Cheishvili N., Chikovani T.”Plaferon.” J. Drugs of the future, 1999, 24 (9), 974-977.
10. Beckman J.S., Koppenol W.H. Nitric oxide superoxide and peroxynitrate. The good, the bad, the ugly. Am.J.Physiol., 1996, v.271, C.1424-C.1437.
11. Bredt D.S., Ferris C.D., Snyder S.A. Nitric oxide synthase requlatory sites. Phosphorylation by cyclic AMP-dependent protein kinase, proteine kinase C and calcium calmodulin protein kinase, identification of blavin and calmodulin binding sites. J.Biol.Chem., 1992, 267: 10976-10981.
12. Chikovani T., Rukhadze R., Bakhutashvili V., Sanikidze T., Pantsulaia J. Antioxidant action of Immunomodulatory drug Plaferon LB in experimental thyroid pathology./ Int. J. on Immunorehab., 1992. № 12. p. 14-18.
13. Frieden E. Ceruloplasmin: a multifunctional metabolloprotein vertebrate plasma // Metal ions in Biological systems / Ed. H. Siegal N.V. Basel Harcel Dekkr Inc., 1981. p. 117-142.
14. Grander D.N. Role of xanthine oxidase and granulocytes in ischemia- reperfution injury. Am. J. Physiol., 1988, 255: H 1269-1275.
15. Greengard P Robinson G A Advances in cyclic nucleotide research. N.Y., Taven Press 1992, v. 14.
16. Halliwell B Oxigen toxicity, oxigen radicals, transition metals and disease. Biochem. J., 1984, v.219, N1, p.1-14.
17. Halliwell B., Oxidants and the central nervous system some fundamental questions. Is oxidant damage relevant to Parkinson’s Disease, Alzheimer’s Disease, traumatic injuri or stroke? Acta Neurol. Scand., 1989, 126: 23-33.
18. Halliwell B. et J.M.C. Gutteridge. Lipid peroxidation a radical chain reaction. In Free Radicals in Biology and Medicine, Clarendon Press.Oxford, 1985, p.139.
19. Kerwin J.F. Jr.,Lancaster J.R., Jr., and Feldman P.L. Nitric oxide: A new paradigm for second messengers. J. Med.Chem., 1995, 38: 4343-4362.
20. Lane T.E., Fox H.S., Buchmeier M.J. Inhibition of nitric caide synthase-2 reduces the severity of mause hepatitis virus-induced demylination: implicatious for NOS 2/NO requlation of chemokine expression and inflammation. J. Neurovizol., 1999 , V.5, № 1, p.48-54.
21. Lovstad R.A. The protective action of ceruloplasmin on Fe2+ stimulated lysis of rat erythrocytes.Int. J. Biochem., 1981, V.13, p. 221-224.
22. Maisuradze E., Garishvili T., Bakhutashvili V. Inhibition of Bee Venom Phospholipase A2 activity by Plaferon LB Bulletin of the Georgian Academy of Sciences, 1998, N2, p.157.
23. Marletta M.A. Nitric oxide synthase: Aspects concerning structure and catalysis Cell, 1994, v.78, p.927-930.
24. McCleventry J.A. Reaction of nitric oxide coordinated to transition metals. Chem. Rev., 1979, 79:53-76.
25. Navicki I. P., Poignet H., Sevatton B. Nitric oxide mediates neuronal death after focal carebral ischemia in the mouse. Ecr. J. Pharmacol., 1991, v. 204/3, p. 339-340.
26. Oden M. The role of reperfusion-induced injury in the pathogenesis of the crush syndrome.The new England J.of Medicine, 1991, v.324, N20, p.1417.
27. Ohara Y., Sayegh H.S., Yamin J.J. and Harrison D.G. Regulation of endothelial constitutive nitric oxide Syntase by protein kinase C. Hypertension , 1995, 25: 415-420.
28. Peterhans E. Oxidants and antioxidants in viral diseases: disease mechanisms and metabolic regulation. J. Nutr., 1997, v. 127 (Suppl). p. 963S-965S.
29. Platt P., Henzel B., John M., Kather M., Rohne E., Mayer B. Ca2+/Calmodulin dependent cytochrome c reductase activity of brain nitric oxide synthase J. Biol. Chem., 1992, v. 267(16) p. 374-378.
30. Ren Evans C., Boysal E., Kontoghiorghes C.A., Flynn D.M., Hoffbrand A.V. Oxidative effects of iron on erythrocytes. Frec Rad. Res. Comm., 1985, V.1 № 1, p. 55-62.
31. Rochelle L.G., Morana S.J. Kruszyna H., Russell M.A., Wilkox D.E., Smith R.P., Interactions between hydroxocobalamin and nitric oxide (NO): Evidence for a redox reaction between NO and reduced cobalamin reversible NO binding to oxidized cobalamin. J.Pharmacol. Exp. Ther., 1995, 275: 48-52.
32. Rosen G.M., Barber M.J., Rauchman E.J. Distruption of еrytrocyte membran organisation by superoxide. J. Bid. Chem., 1983, V. 258, p. 2225.
33. Stuehr D.J., Griffith O.W. Mammalian oxide nitric synthases. Adv. Enzymol. Relat.Arcas. Mol. Biol., 1992, 65: 287-346.
34. Tuttle T.M., Williams G.M., Marchall F.F. Evidence for cyclophosphamide induced transitional cell carcinoma in a renal transplant patient. J. Urol., 1988, V. 140. № 5, P. 1009-1011.
35. Vanin A.F., Menshikov G.B., Moroz I.A., Mordvinteev P.I., Serezhenkov V.A., Burbaev D.S. The source of nonheme iron that binds nitric oxide in cultivated macrophages. Biophys. Acta, 1992, 1135: 275-279.
Summary
Peculiariti and correction oxidant stress in the experimental traumatic shock
Nakashidze I., Chikovani T., Sanikidze T., Bakhutashvili V., Kevlishvili O.
Institute of Medical Biotechnology, Tbilisi, Georgia
Aim: The goal of our research was to investigate the changes of oxidative–antioxidative systems occurred during the experimental traumatic shock.
Methods: Experiment was held on 30 white rats weighing 200gr. Traumatic shock was induced by the injury of soft tissues according to the Cannon method. The decreasing of the arterial blood pressure was concomitant of the shock development. 60 mm of the mercury line was the threshold of the shock development. 15 minutes later (from the shock development) the first group animals were injected by the saline 0,3ml intraperitoneum. The animals of the second group were injected by Plaferon LB 0,6 mg on 0,3 ml the saline. 30 minutes later from injections, rats were killed. The blood was taken from the jugular vein and was studied by biochemical and electron spin resonance (ESR) spectrometry technique on radiospectrometer RE-1307.
Results: The study revealed that traumatic shock is characterized by activation of lipid peroxidation, hyperproduction of free radicals and inhibition of endogenic antioxidant system. Plaferon LB significantly decreases processes of lipid peroxidation and improved antioxidative capacity of blood.
Key words: traumatic shok, oxidant sistem